Ako sa v BMC SAV testuje koronavírus

Vo Virologickom ústave Biomedicínskeho centra SAV sa začína testovanie vzoriek na prítomnosť koronavírusu SARS-CoV-2 spôsobujúceho ochorenie COVID-19. Používa sa metóda real-time RT-PCR, ktorá je založená na technikách molekulárnej biológie. Pomocou tejto metódy sa zisťuje prítomnosť vírusovej RNA, ktorá obsahuje genetickú informáciu vírusu.

Protokol odporúčaný Svetovou zdravotníckou organizáciou bol vyvinutý vo Virologickom ústave univerzitnej kliniky Charité v Berlíne, s ktorým je Virologický ústav BMC SAV spojený aj výskumnými aktivitami v rámci projektu Európskeho vírusového archívu s globálnym rozsahom (EVA-GLOBAL). Virologický ústav BMC SAV je jedným zo zakladajúcich členov konzorcia Európskeho vírusového archívu.

Vírusová infekcia

• RNA vírusu SARS-CoV-2 je uložená v jadre vírusovej častice, ktorá je chránená bielkovinovým obalom.
• Keď sa vírusová častica prostredníctvom svojho receptora dostane do bunky, RNA sa odbalí a využije bunkový aparát na vlastné zmnoženie a produkciu vírusových bielkovín potrebných na nové vírusové častice. Tie sa z bunky uvoľnia vo veľkom množstve a infikujú ďalšie bunky a tkanivá.
• Tento proces sa deje v priebehu niekoľkých dní po infekcii a počas neho je možné vírusovú RNA zistiť vo vzorkách zo sterov slizníc nosa a ústnej dutiny pomocou metódy nazývanej polymerázová reťazová reakcia s reverznou transkripciou, skrátene RT-PCR.
• Po nástupe symptómov, ktorých rozsah závisí od infekčnej dávky (množstva viriónov pri nákaze) aj zdravotného stavu infikovanej osoby, sa organizmus infikovanej osoby bráni pomocou imunitnej reakcie, ktorá je spočiatku nešpecifická a jej súčasťou je v horších prípadoch akútny zápalový proces.
• Počas ochorenia dochádza k tvorbe protilátok voči vírusovým bielkovinám, ktoré je možné zistiť sérologickými metódami. Podľa poznatkov z epidémie SARS v roku 2003 táto protilátková odpoveď nastupuje 1 – 3 týždne po infekcii. Trvanlivosť protilátok vytvorených voči SARS-CoV-2 a ich ochranná schopnosť nie je zatiaľ známa.

Testovanie vzoriek na prítomnosť vírusovej RNA metódou RT-PCR

• RT-PCR je citlivá molekulárne metóda, ktorou je možné odhaliť prítomnosť vírusu hneď v začiatkoch infekcie, 1 – 2 dni pred nástupom symptómov. Ide o metódu, ktorá dokáže cielene namnožiť vybrané vírusové gény v skúmavke.
• Táto metóda sa v súčasnosti využíva na kontrolu šírenia infekcie koronavírusu SARS-CoV-2.
• Na rozdiel od PCR metódy bežne používanej na klinickú diagnostiku na báze neinfekčnej DNA, v prípade koronavírusu sa vychádza z infekčného materiálu, z ktorého sa izoluje vírusová RNA.
• Vírusová RNA sa pomocou enzýmov prepíše na DNA (ktorá je vernou kópiou vírusového génu) a DNA sa potom v zmesi špecifických fluoreskujúcich reagencií a enzýmov namnoží do takého množstva, ktoré je možné zistiť na základe svetelných signálov, ktoré sa zaznamenávajú počas jej množenia.
• Ak je východiskové množstvo vírusovej RNA vysoké, svetelný signál sa zaznamená v skoršej fáze množenia.
• Na základe porovnania výsledku s negatívnymi a pozitívnymi kontrolami sa určí, či analyzovaná vzorka obsahovala vírus.
• Schéma uvedená nižšie znázorňuje základné kroky pri testovaní koronavírusu metódou real-time RT-PCR.

Schéma znázorňujúca základné kroky pri testovaní koronavírusu metódou real-time RT-PCR.

Detekcia koronavírusu SARS-CoV-2 nemôže byť realizovaná v bežnom molekulárnom laboratóriu. Keďže ide o prácu s potenciálne infekčným materiálom, je nevyhnutné zabezpečiť ochranu pracovníkov realizujúcich testovanie. Na druhej strane je potrebné zabrániť tomu, aby sa do PCR reakcie dostali molekuly vírusovej RNA vzdušnou kontamináciou, pretože by znehodnotili testovanú vzorku.

Vo Virologickom ústave Biomedicínskeho centra SAV sa preto na účely testovania vzoriek využívajú laboratóriá, ktoré majú oddelené priestory pre realizáciu každého kroku v procese testovania. Testovanie pod vedením RNDr. Borisa Klempu, DrSc. a za organizačnej podpory vedeckého riaditeľa Virologického ústavu BMC SAV vykonávajú vedeckí pracovníci, ktorí metódu RT-PCR využívajú vo svojej vedeckej práci, vrátane virológov a molekulárnych biológov. Hlavný realizačný tím je z Oddelenia ekológie vírusov, ale do testovania sa chcú dobrovoľne zapojiť aj ďalší odborníci z Biomedicínskeho centra SAV, ako aj množstvo ďalších kolegov zo SAV či iných akademických inštitúcii.

ZÁZNAM Z TLAČOVEJ KONFERENCIE (19. 03. 2020)

VIDEO: Virologický ústav BMC SAV – testovanie vzoriek na prítomnosť koronavírusu (25. 03. 2020)

Autori: vedeckí pracovníci Virologického ústavu Biomedicínskeho centra SAV